INC國際兒童腦瘤大咖、世界神經(jīng)外科聯(lián)合會(huì)(WFNS)執(zhí)行委員會(huì)&顧問委員會(huì)成員之一的James T. Rutka教授發(fā)表研究《In situ tissue pathology from spatially encoded mass spectrometry classi?ers visualized in real time through augmented reality》(通過增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)技術(shù)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)可視化的原位組織病理學(xué)分析)，以下是研究簡述。

　　01. 摘要

　　基于皮秒紅外激光技術(shù)(PIRL-MS)的手持式質(zhì)譜解吸探針與光學(xué)手術(shù)跟蹤系統(tǒng)的集成，展示了通過點(diǎn)采樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行的原位組織病理學(xué)分析。空間編碼的病理分類結(jié)果以顏色編碼像素的形式顯示在激光采樣的位置，并通過增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)視頻流實(shí)時(shí)呈現(xiàn)于手術(shù)視野中。這一功能通過定制接口實(shí)現(xiàn)了手術(shù)導(dǎo)航平臺(tái)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析平臺(tái)之間的雙向通信。該系統(tǒng)性能通過小鼠癌癥模型(模擬人類癌癥)進(jìn)行了評估，在存在體液的情況下，技術(shù)像素誤差為1.0±0.2毫米，表明在不同分子模型中，乳腺、腦、頭頸癌小鼠模型的細(xì)胞系分類準(zhǔn)確率，分別為84%或92%(排除一個(gè)異常值)。此外，通過針對DNA損傷、細(xì)胞死亡和神經(jīng)元活性的終點(diǎn)免疫組化染色驗(yàn)證，空間編碼的PIRL-MS采樣能夠從活體小鼠腦組織中獲取可分類的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其神經(jīng)元損傷程度與手術(shù)刀引起的損傷相當(dāng)。這突出了空間編碼PIRL-MS分析在神經(jīng)外科手術(shù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值，例如用于癌癥類型確定或在腫瘤床檢查中進(jìn)行活體組織定點(diǎn)采樣以評估癌癥切除情況。本文開發(fā)的用于分析和顯示空間編碼PIRL-MS數(shù)據(jù)的接口，可以適應(yīng)目前可用的其他手持式質(zhì)譜分析探針。

　　02. 材料與方法

　　GTxEyes和AMX的空間編碼質(zhì)譜整合。

　　PIRL探針與光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)(NDI Polaris)和定制的3D可視化軟件(GTxEyes)相結(jié)合，用于空間編碼質(zhì)譜分析。光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)使用兩個(gè)紅外(IR)攝像機(jī)跟蹤由四個(gè)被動(dòng)紅外反射球組成的IR傳感器，該傳感器附著在激光探針上。此外，還將一個(gè)四球IR傳感器附著在Logitech C920 USB攝像頭上，以空間關(guān)聯(lián)跟蹤探針位置與攝像機(jī)的位置關(guān)系。光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)和定制軟件此前已有描述，包括在錐形束計(jì)算機(jī)斷層掃描(CBCT)引導(dǎo)的骨切開術(shù)、改善放射治療中淺表病變勾畫的定量內(nèi)窺鏡，以及CBCT與頭頸部手術(shù)內(nèi)窺鏡的結(jié)合中的應(yīng)用。GTxEyes定制軟件實(shí)現(xiàn)了跟蹤器械與成像模式(如CT、MR和光學(xué)成像)及參數(shù)信息(結(jié)合手術(shù)或放射治療計(jì)劃數(shù)據(jù))的共同配準(zhǔn)和實(shí)時(shí)可視化。該軟件還對跟蹤和校準(zhǔn)的光學(xué)攝像機(jī)進(jìn)行偏移校正，附著的IR球與攝像機(jī)的光學(xué)中心配準(zhǔn)。

　　在本研究中，將上述光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)的跟蹤攝像機(jī)和Logitech C920攝像機(jī)放置在生物安全柜中，使Logitech C920能夠看到激光探針，且激光探針和Logitech C920的IR傳感器均在跟蹤攝像機(jī)的可視范圍內(nèi)。通過光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)跟蹤的預(yù)校準(zhǔn)指針確定激光探針尖端相對于附著IR傳感器的位置，該指針通過“拾取”其燒灼點(diǎn)追蹤到探針尖端以外的消融點(diǎn)，并通過虛擬指針模型模擬在激光束尖端遠(yuǎn)離組織表面處的消融過程。運(yùn)行GTxEyes軟件的筆記本電腦通過以太網(wǎng)連接連接到光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)、Logitech C920攝像機(jī)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集與處理計(jì)算機(jī)。GTxEyes軟件同時(shí)收集激光探針和Logitech C920攝像機(jī)的跟蹤測量數(shù)據(jù)，進(jìn)行反投影以確定相應(yīng)的像素位置，并根據(jù)質(zhì)譜分析計(jì)算機(jī)輸出的分類結(jié)果對像素進(jìn)行顏色編碼。質(zhì)譜圖通過Waters AMX識(shí)別軟件中的主成分分析線性判別分析(PCA-LDA)與預(yù)訓(xùn)練模型進(jìn)行處理。

　　定制的GTxEyes軟件集成了OpenIGTLink客戶端，以輪詢和流式傳輸AMX識(shí)別軟件內(nèi)置OpenIGTLink服務(wù)器的分類結(jié)果。每個(gè)分類幀包含一個(gè)組織分類ID和時(shí)間戳。然后在GTxEyes軟件中創(chuàng)建顏色查找表，以匹配AMX識(shí)別中每個(gè)分類的標(biāo)簽顏色。顏色查找表將接收到的組織分類ID映射到RGB元組。對于跟蹤的激光探針位置，通過Logitech C920攝像機(jī)的內(nèi)在和外在參數(shù)(分別通過攝像機(jī)校準(zhǔn)和光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)確定)進(jìn)行反投影，以確定像素坐標(biāo)中的探針尖端位置。GTxEyes實(shí)時(shí)計(jì)算激光探針和Logitech C920攝像機(jī)每個(gè)IR傳感器測量的像素位置。在從AMX識(shí)別接收分類輸出幀后，GTxEyes軟件根據(jù)查找表中的RGB值對Logitech C920視頻幀的相應(yīng)像素進(jìn)行著色。

　　動(dòng)物模型異種移植物的生成、PIRL-MS分析以及顱骨切開術(shù)和組織學(xué)分析的更多詳細(xì)信息在ESI中提供。

　　03. 結(jié)論與討論

　　圖1.增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)顯示采樣點(diǎn)組織病理的空間編碼質(zhì)譜結(jié)果。本圖展示了(A)在采樣點(diǎn)原位顯示組織病理所需的空間編碼質(zhì)譜的組件，以及這些組件之間的相互作用。組織采樣通過氣溶膠化方法進(jìn)行以產(chǎn)生質(zhì)譜。然后將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與預(yù)先存在的多變量病理模型(或庫)進(jìn)行比較，并進(jìn)行分類。在我們展示的應(yīng)用中，采樣是使用PIRL-MS進(jìn)行的，多變量分析是使用AMX的PCA-LDA完成的。病理分類實(shí)時(shí)可用，并與從跟蹤數(shù)據(jù)導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的“集成器”程序GTxEyes中的采樣探針的位置信息(坐標(biāo))相結(jié)合。通過定制的鏈接將分類器從AMX傳輸?shù)紾TxEyes，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入。然后，利用軟件中之前集成的采樣視野攝像機(jī)饋送，GTxEyes軟件可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)顯示彩色編碼的病理信息。

　　(B)圖A中系統(tǒng)組件的示意圖及其相互作用。在適當(dāng)?shù)牡胤?，我們已獲得重用圖形的許可。NDI Polaris跟蹤攝像機(jī)監(jiān)測探針位置以及提供采樣事件實(shí)時(shí)視頻饋送的Logitech跟蹤攝像機(jī)的位置。質(zhì)譜信號(hào)經(jīng)過處理，并使用AMX進(jìn)行多變量分析。所有組件向GTxEyes平臺(tái)提供數(shù)據(jù)，該平臺(tái)反過來將質(zhì)譜分析的分子信息與定位數(shù)據(jù)整合，以增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)的方式顯示空間編碼質(zhì)譜分類器。在此，小鼠異種移植物的原位采樣使得質(zhì)譜的組織類型分類能夠以假彩色顯示在增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)屏幕上。使用部分先前發(fā)布的圖形文件，概念性地展示了空間編碼質(zhì)譜的輸出顯示(經(jīng)皇家化學(xué)學(xué)會(huì)和美國癌癥研究協(xié)會(huì)許可)。圖形文件經(jīng)過修改后在此處重現(xiàn)，說明了使用PIRL-MS和異種移植物組織的輸出顯示。

　　圖2.空間編碼PIRL-MS采樣用于原位病理學(xué)確定，并實(shí)時(shí)顯示結(jié)果。通過增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)顯示了基于質(zhì)譜讀數(shù)(PIRL-MS)的PCA-LDA建模的假彩色組織病理分類器，每個(gè)分類(即病理評估)在采樣點(diǎn)(激光尖端)處以假彩色編碼，并在攝像機(jī)饋送的采樣視野中顯示。該圖提供了癌癥邊界評估應(yīng)用(使用體外組織)和原位病理學(xué)(使用攜帶腫瘤的小鼠)的示例結(jié)果。

　　(A)通過將小鼠異種移植物髓母細(xì)胞瘤腫瘤塊放置在正常小鼠腦組織旁邊，創(chuàng)建了一個(gè)人工組織邊界，用于評估空間編碼PIRL-MS結(jié)果。PIRL-MS探針以連續(xù)的速度掃描并跨越組織邊界(綠色軌跡)，每5秒對平均數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，使用先前數(shù)據(jù)建立的包含健康小鼠腦和Med8A癌癥的兩組分PCA-LDA模型。該分類顯示在5秒采樣周期結(jié)束時(shí)的空間編碼位置，并在跨越邊界時(shí)從健康組織變?yōu)榘┌Y。實(shí)時(shí)視頻顯示了連續(xù)掃描和增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)顯示的分類結(jié)果，已作為ESI提供。

　　(B)使用攜帶腫瘤的小鼠驗(yàn)證原位病理學(xué)應(yīng)用(總結(jié)在表1中)。在這里，髓母細(xì)胞瘤的Med8A和DAOY亞組的細(xì)胞被皮下雙側(cè)注射，形成了小的1 mm³和3.3 mm³腫瘤，用圓圈標(biāo)記以指導(dǎo)讀者找到它們的位置。這些亞組先前已被證明可以通過PIRL-MS進(jìn)行分類，本研究中使用包含DAOY、Med8A和肌肉組織特征的三組分模型對它們進(jìn)行空間編碼PIRL-MS分類。在采樣點(diǎn)(激光尖端)處得到了這些小腫瘤的預(yù)期假彩色空間編碼分類結(jié)果。類似的方法也被用來評估表1中總結(jié)的其他癌癥類型的表現(xiàn)，報(bào)告了良好的指標(biāo)。

　　圖3.使用小鼠模型在實(shí)際使用場景下評估PIRL-MS對神經(jīng)組織的損傷。通過顱骨切開術(shù)使激光探針和手術(shù)刀能夠接觸腦組織。在麻醉狀態(tài)下，使用PIRL-MS(n=8)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)進(jìn)行表面“切口”，并使用手術(shù)刀(不采集質(zhì)譜數(shù)據(jù))進(jìn)行切口。

　　(A)使用先前結(jié)果中新鮮或冷凍體外組織的混合物對小鼠器官數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA-LDA建模，顯示在活體小鼠麻醉下獲取的體內(nèi)數(shù)據(jù)點(diǎn)按預(yù)期分類為器官類型，表明血液或體液的存在并未妨礙分類。

　　(B)實(shí)驗(yàn)設(shè)置：小鼠麻醉并固定在立體定位裝置中，進(jìn)行局部顱骨切開術(shù)，并應(yīng)用PIRL探針或手術(shù)刀創(chuàng)建表面切口。

　　(C)組織病理學(xué)工作流程示意圖。如實(shí)驗(yàn)部分所述，使用數(shù)字病理學(xué)通過TUNEL(DNA損傷)、Caspase-3(細(xì)胞死亡)和NeuN(神經(jīng)元活性)染色陽性細(xì)胞量化損傷程度。每個(gè)組織切片在終點(diǎn)時(shí)被分為4個(gè)象限，如“分割”面板所示，利用腦組織的生物對稱性，比較受損象限(激光探針或手術(shù)刀與腦組織接觸處)與對照象限(未與激光或手術(shù)探針接觸處)的探針損傷程度。對照象限的任何損傷均來自犧牲后從顱骨中提取腦組織的過程。如本面板所示，受損象限的探針損傷(箭頭標(biāo)記)是表面性的，并與顱骨切開術(shù)本身造成的損傷疊加。因此，報(bào)告并比較的激光和手術(shù)刀之間的所有損傷值均報(bào)告為“探針+顱骨切開術(shù)”損傷。報(bào)告對照象限值以說明敏感性。然而，面板(A)中呈現(xiàn)的PIRL-MS分類光譜表明，在實(shí)驗(yàn)條件下造成了一定程度的神經(jīng)損傷。

　　圖4.小鼠模型中激光誘導(dǎo)的神經(jīng)組織損傷的組織病理學(xué)分析表明，PIRL與手術(shù)刀相比具有非劣效性。如正文所述，通過數(shù)字病理學(xué)方法對19只小鼠的76張組織病理學(xué)切片(激光組n=9.手術(shù)刀組n=10)進(jìn)行分析，評估了DNA損傷(TUNEL染色)、細(xì)胞死亡(Caspase 3染色)和神經(jīng)元活性(NeuN染色)。分別在24小時(shí)(評估即時(shí)神經(jīng)損傷)和兩周(評估長期損傷)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測量。每個(gè)柱狀圖中的對照測量值指的是根據(jù)圖3C所示示意圖中對照象限的染色陽性細(xì)胞測量值。誤差條表示均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。即使在對照組和實(shí)驗(yàn)組測量值未見顯著差異的情況下，組織病理學(xué)切片的目視檢查表明受損象限可能有部分物質(zhì)缺失(見圖3C)。考慮到“缺失”的物質(zhì)可能包含一些受損細(xì)胞，這些細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)在分析中，從而引入偏差，我們確認(rèn)小鼠在PIRL-MS采樣后存活。星號(hào)表示與對照組相比，每個(gè)隊(duì)列中統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的測量值。除了Caspase 3染色外，其他情況下對照組和實(shí)驗(yàn)組測量值之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。然而，激光和手術(shù)刀之間的損傷程度并無差異，表明PIRL具有非劣效性。這一觀察結(jié)果在三種染色中均成立。激光和手術(shù)刀(主要由于顱骨切開術(shù)本身的侵入性)引起的即時(shí)DNA損傷(TUNEL染色)在兩周內(nèi)大多恢復(fù)(圖S4)。為了比較激光和手術(shù)刀的損傷，在24小時(shí)和兩周時(shí)對激光和手術(shù)刀損傷區(qū)域進(jìn)行了雙樣本t檢驗(yàn)(假設(shè)方差不等，α=0.05)。與兩周手術(shù)刀損傷組相比，兩周激光損傷組的TUNEL染色顯著減少(p=0.035)。在所有其他情況下，差異均不顯著。因此，我們的測試表明，PIRL-MS采樣在神經(jīng)組織損傷方面與手術(shù)刀相比具有非劣效性。

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