INC國際兒童腦瘤大咖、世界神經外科聯(lián)合會(WFNS)執(zhí)行委員會&顧問委員會成員之一的James T. Rutka教授發(fā)表研究《Transient receptor potential melastatin 7 signaling in U251 cell migration and invasion involves calcineurin》(U251細胞遷移和侵襲中瞬時受體電位褪黑素7信號通路涉及鈣調神經磷酸酶)，以下是研究簡述。

　　01. 摘要

　　瞬時受體電位褪黑素7(TRPM7)是一種二價陽離子通道，在膠質母細胞瘤(GBM)中發(fā)揮著關鍵作用。GBM是成人中最常見且最致命的原發(fā)性腦腫瘤。既往研究顯示，改變TRPM7的活性會影響GBM細胞的功能，包括細胞的遷移、侵襲和增殖。因此，闡明GBM中TRPM7介導的信號通路可能會揭示新的治療靶點。鈣調神經磷酸酶是一種鈣依賴性磷酸酶，同樣影響GBM細胞的存活和遷移。然而，TRPM7與鈣調神經磷酸酶在GBM信號傳導中的作用或關系尚未被研究。在這項研究中，我們提供了證據，表明在GBM細胞系U251中，TRPM7與鈣調神經磷酸酶之間可能存在相互作用。此外，我們采用藥理學方法證明，TRPM7調節(jié)鈣調神經磷酸酶的功能，這表明在U251細胞的遷移和侵襲中，鈣調神經磷酸酶是TRPM7信號傳導的潛在下游靶點。

　　02. 研究結果

　　(1)帶有Flag標簽的TRPM7從HEK293和U251細胞裂解液中免疫沉淀出鈣調神經磷酸酶A亞基。

　　圖 1：在HEK293和U251細胞中，F(xiàn)lag-TRPM7免疫沉淀鈣調神經磷酸酶A亞基。通過免疫印跡法分析了來自(A)HEK293細胞裂解液和(B)U251細胞裂解液的Flag-TRPM7相關蛋白復合物。在共免疫沉淀(co-IP)和輸入(HEK293或U251細胞總裂解液)泳道中均檢測到TRPM7(212 kDa)和鈣調神經磷酸酶A(61 kDa)，而在陰性對照泳道(未使用抗Flag抗體進行共免疫沉淀的結果)中均未出現(xiàn)?？s寫：TRPM7：瞬時受體電位黑素瘤7.

　　(2)鈣調蛋白在TRPM7與鈣調神經磷酸酶的相互作用中并不發(fā)揮中介作用。

　　圖2：在U251細胞裂解液中，組氨酸標記的鈣調蛋白可沉淀鈣調神經磷酸酶A，但不沉淀TRPM7.將純化的6×組氨酸標記的鈣調蛋白加入U251細胞總裂解液中。在缺乏Ca2+的情況下，蛋白復合物被沉淀并用西方印跡法分析。陽性對照組包含U251細胞裂解液和組氨酸標記的鈣調蛋白。作為陰性對照，也進行了不加組氨酸標記的鈣調蛋白的沉淀實驗。在沉淀的洗脫樣品中檢測到鈣調神經磷酸酶A(61 kDa)和組氨酸標記的鈣調蛋白(20 kDa)，而TRPM7通道蛋白(212 kDa)僅存在于上清液中?？s寫：TRPM7：瞬時受體電位黑素瘤7.

　　(3)抑制鈣調神經磷酸酶可增加TRPM7蛋白的表達。

　　圖3：鈣調神經磷酸酶抑制增加TRPM7蛋白和mRNA水平。(A)用載體(DMSO;對照)或CsA(10、20、40或80 µM)處理U251細胞24小時后進行CCK-8實驗(n = 10/組)。分析采用單因素方差分析(**p < 0.01)。(B–D)細胞在RNA或蛋白提取前24小時用載體(DMSO;對照)或10 µM CsA處理。(B)西方印跡帶的代表性圖像和(C)以GAPDH為對照的曝光強度，使用ImageJ處理，并用t檢驗進行統(tǒng)計分析(*p < 0.05;n = 8或9/組)。(D)使用qRT-PCR檢測TRPM7 mRNA水平，并以GAPDH為參考基因。用t檢驗分析對照組和處理組之間的差異(***p < 0.001;n = 6/組)?？s寫：TRPM7：瞬時受體電位黑素瘤7;CsA：環(huán)孢素A。

　　(4)使用TRPM7激活劑并不能逆轉鈣調神經磷酸酶抑制對U251細胞遷移和侵襲的影響。

　　圖4：CsA和naltriben聯(lián)合治療對U251細胞遷移和侵襲的抑制作用與單獨使用CsA治療相似。細胞用DMSO載體、CsA和/或naltriben(分別為10和25 µM)處理。(A)傷口愈合實驗。在劃痕后0和24小時拍攝圖像，并使用ImageJ勾勒傷口大小。(B)采用單因素方差分析和事后圖基檢驗比較各組傷口閉合百分比(*p < 0.05;與25 µM naltriben組相比：#### p < 0.0001;與10 µM CsA組相比：ns，無顯著差異;n = 7/組)。比較10 µM CsA組與對照組時，發(fā)現(xiàn)有顯著的中度減少(p < 0.05)。(C)奧里斯遷移實驗。在傷口形成后0、12、24和48小時拍攝圖像，并使用ImageJ勾勒傷口大小。(D)采用單因素方差分析和事后圖基檢驗比較各組傷口閉合百分比(*p < 0.05;**p < 0.01;與25 µM naltriben組相比：#### p < 0.0001;與10 µM CsA組相比：ns，無顯著差異;n = 7/組)。(E)馬特里格爾侵襲實驗。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗評估統(tǒng)計學意義(ns，無顯著差異;**p < 0.01.與對照組相比;#### p < 0.0001.與25 µM naltriben組相比;n = 3/組)。比較10 µM CsA組與對照組時，發(fā)現(xiàn)有中度減少的趨勢(p = 0.131)?？s寫：CsA：環(huán)孢素A;ANOVA：方差分析。

　　(5)環(huán)孢素A(CsA)誘導的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的變化不受納爾曲苯(naltriben)的影響。

　　圖5：CsA和naltriben聯(lián)合治療對AKT和ERK磷酸化水平的影響與單獨使用CsA治療相似。細胞在蛋白收集進行西方印跡前24小時用載體、CsA和/或naltriben(分別為10或25 µM)處理。使用ImageJ分析光密度。(A)代表性圖像和(B、C)p-AKT和t-AKT水平的統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗評估顯著差異(**p < 0.01.與對照組相比;#### p < 0.0001.與25 µM naltriben組相比;n = 7/組)。(D)代表性圖像和(E、F)p-ERK和t-ERK水平的統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗評估統(tǒng)計學意義(各組間無顯著差異;n = 4/組)。需要注意的是，盡管與對照組相比，10 µM CsA組和聯(lián)合治療組有降低的趨勢，但我們并未觀察到顯著性(p > 0.05)?？s寫：CsA：環(huán)孢素A;ANOVA：方差分析。

　　圖6：使用 Biorender 創(chuàng)建的圖形摘要。

　　03. 結論

　　現(xiàn)有的研究結果表明，瞬時受體電位褪黑素7(TRPM7)通道與鈣調神經磷酸酶A亞基蛋白之間存在相互作用，這種相互作用可能是直接的，也可能是間接的。異常的TRPM7活性可以通過多種途徑增強膠質母細胞瘤(GBM)細胞的功能，而鈣調神經磷酸酶可能是其潛在的下游靶點之一(圖6)。在本研究中，我們采用了一種GBM細胞系(即U251)來闡明這一機制。需要注意的是，目前在U251細胞系中獲得的研究結果可能并不能完全反映TRPM7在膠質瘤干細胞中介導的信號傳導特性。未來的研究應考慮使用其他GBM細胞系以及膠質瘤干細胞來進一步驗證TRPM7與鈣調神經磷酸酶之間的相互作用。通過在TRPM7介導的信號通路中識別潛在的藥物靶點，我們的最終目標是推動新型化療藥物的研發(fā)，為GBM的治療提供新的手段。

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• 更新時間：2025-03-26 11:30:05

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